Статическое и динамическое рассеяние света для определения абсолютного молекулярного веса и гидродинамического радиуса биомолекул

Источник: Precision Detectors Inc.

Джон П. Хелфрич, Precision Detectors Inc.

содержание
Вступление
Технология рассеяния света
Применение биомолекул
Бычий сывороточный альбумин (БСА)
Терапевтический белок (конфиденциальная структура)
Моноклональное антитело
ДНК-плазмиды
Выводы
Рекомендации

Вступление (Вернуться к началу)
Распределения молекулярной массы и / или молекулярной массы являются основными параметрами для характеристики макромолекулярных биомолекул, таких как белки, полисахариды, олигонуклеотиды и антитела. Традиционные аналитические методы определения молекулярной массы включают эксклюзионную хроматографию (SEC), гель-электрофорез и, в последнее время, рэлеевское рассеяние света и времяпролетную масс-спектрометрию (MALDI-TOF-MS). Несмотря на фундаментальную природу средней молекулярной массы, определению ее значения часто препятствуют неоднородность образца, полидисперсность, термодинамическая неидеальность и, во многих случаях, самоассоциация. Очень часто большие биомолекулы агрегируют в зависимости от температуры, pH, ионной силы и концентрации. Эти эффекты вызывают конформационные изменения в молекулярной структуре, которые могут изменить функцию биомолекул в качестве терапевтических или диагностических агентов. Понимание этих идей имеет основополагающее значение для исследований, разработок и процессов производства / контроля качества современных биомолекул.

Релеевские или статические лазерные детекторы рассеяния света используются уже более десяти лет для определения молекулярно-массовых характеристик промышленных полимеров, таких как полистирол, поликарбонат и полиолефины (полиэтилен и полипропилен). Последние инновации в современных высокоскоростных электронных компонентах, таких как высокопроизводительные диодные лазеры, высокоскоростные цифровые сигнальные процессоры и современные лавинные фотодиодные детекторы, привели к появлению нового динамического детектора рассеяния лазерного света. Этот комбинированный статический и динамический светорассеивающий детектор имеет конструкцию проточной ячейки 10 мкл и способен характеризовать как молекулярный вес, так и размер для биомолекул, элюируемых с помощью современных приборов ВЭЖХ / SEC. Этот новый детектор и соответствующее программное обеспечение обеспечивает:

• Данные по абсолютной молекулярной массе для каждого элюирующего компонента.
  
• Гидродинамический радиус (Rh) - по данным DLS.
  
• Rh с данными о распределении молекулярной массы дает представление о молекулярной форме и конформации.
  
• Высокая чувствительность агрегации и самоассоциации.

Технология рассеяния света (Вернуться к началу)
Когда поляризованный монохроматический лазерный луч проходит через растворитель, содержащий биомолекулы, избыточный свет, рассеянный молекулами под углом к ​​падающему лучу, по сравнению с рассеянным только растворителем, прямо пропорционален молекулярной массе (Mw), умноженной на концентрацию биомолекулы. Для большинства биомолекул на основе белка единый угол сбора 90º - это все, что необходимо для определения точного молекулярного веса (1). Для очень больших молекул (как правило, больше 800 кДа) сбор рассеянного лазерного света под двумя углами (90 ° и низкий угол 15 °) обеспечит точную молекулярную массу и расчет радиуса вращения (Rg). Кроме того, когда биомолекулы проходят через проточную ячейку объемом 10 мкл, они испытывают броуновское движение, которое связано с их гидродинамическим радиусом (Rh) в соответствии с уравнением Стокса-Эйнштейна. Посредством использования высокоскоростного детектора счета фотонов, установленного под углом 90º от падающего лазерного луча, постоянная диффузии рассчитывается по времени затухания автокорреляционной функции рассеянного света. Это похоже на эффект доплеровского сдвига звуковых частот, излучаемых движущимся источником. Из константы диффузии рассчитывается Rh. Ключевой характеристикой этой новой технологии DLS является ее очень высокая чувствительность и уникальная способность работать в режиме потока с системой ВЭЖХ / SEC и рассчитывать Rh для каждого среза элюирования во время хроматографического разделения.

Использование этого «абсолютного» детектора в качестве ортогонального метода к традиционным данным SEC обеспечивает подтверждение данных для нормативных представлений и соблюдения требований. Контур этой новой комбинированной платформы для динамического и статического рассеяния лазерного света показан на рисунке 1.

Применение биомолекул (Вернуться к началу)
Динамическое детектирование рассеяния света может применяться к большинству растворимых биомолекул, таких как белки, крупные полипептиды, полисахариды, олигонуклеотиды, ДНК-плазмиды и антитела, имеющие молекулярную массу, как правило, более 10 кДа. Детектор полностью способен характеризовать молекулы, имеющие Rh в диапазоне от 1,5 нм до 1000 нм. Если распределение молекулярной массы является единственной необходимой информацией, статический детектор рассеяния света может «видеть» ниже 5 кДа.

Многие приложения включают характеристику агрегации белка и / или изменений конформации в зависимости от времени, температуры, pH, гликозилирования и т. Д. Кроме того, критические регуляторные вопросы, касающиеся «целостности» элюирующего белка из колонки SEC, можно четко выяснить, определив гидродинамический радиус элюирующих фракций по всему пику. Любое возмущение в Rh через пик, когда он элюируется, отражает совместное загрязнение или изменение структуры молекулы. В следующих приложениях будут приведены типичные данные, полученные с помощью динамического обнаружения рассеяния света в «режиме потока»

Бычий сывороточный альбумин (БСА) (Вернуться к началу)
На фиг.2 бычий сывороточный альбумин характеризуется менее чем за 30 минут с использованием детектора показателя преломления и одновременных статических и динамических детекторов рассеяния лазерного света (DLS). Высокая чувствительность детектора DLS (при введении всего 160 мкг) ясно показала наличие четко определенного компонента агрегации в диапазоне димера и незначительное количество тримера. Кроме того, автокорреляционная функция «на лету» рассчитывает, что Rh мономера и димера составляет 3,5 нм и 4,4 нм соответственно в то же время, что и абсолютная молекулярная масса. Было определено, что димер составляет приблизительно 10% от общей массы, что составляет только 16 мкг материала, «видимого» и анализируемого с помощью DLS.

фигура 2

Терапевтический белок (конфиденциальная структура) (Вернуться к началу)
Фиг.3 представляет собой SEC-разделение запатентованного терапевтического белка 22 кДа. Эта хроматография QC и анализ DLS показывают три компонента. Область C является основным компонентом с определением молекулярной массы (через статическое рассеяние света при 90º) 22 кДа. Кроме того, расчет размера «на лету» указывает Rh 2,6 нм. Эта корреляция Mw и Rh полезна для улучшенных данных контроля качества. Первоначально считалось, что область B является димером основного компонента, однако ее молекулярная масса всего 23 кДа (путем рассеяния света) указывает на то, что это, скорее всего, гликозилированный аддукт основного белка. Однако область А указывает на димер, поскольку было определено, что молекулярная масса составляет 42 кДа, как и ожидалось для структуры димера.

Рисунок 3

Моноклональное антитело (Вернуться к началу)
Моноклональные антитела являются одними из наиболее изученных биомолекул из-за их сложности и тонких изменений биоактивности в зависимости от конформационных изменений. Простые конформационные изменения из-за вариаций гликозилирования могут вызывать существенные фармакологические и иммунореактивные эффекты. Использование DLS для характеристики моноклональных антител позволяет рассчитывать гидродинамический радиус в реальном времени по всему молекулярно-молекулярному распределению моноклонального антитела. На фиг.4 показано человеческое моноклональное антитело, разделенное SEC с прямым элюированием в детектор динамического рассеяния света. DLS имеет более высокую чувствительность к компоненту с большей молекулярной массой с соответствующими значениями Rh (в нм), нанесенными на график по всей биомолекуле. Анализ изменений Rh в зависимости от различных условий (pH, температуры, концентрации и т. Д.) Позволяет исследователям лучше понять фармакологическую деятельность и позволяет отделам контроля качества обеспечить соответствие своего продукта / процесса для нормативных представлений.

Рисунок 4

ДНК-плазмиды (Вернуться к началу)
Основные исследования в области генной терапии направлены на конструирование и доставку белков-продуцирующих материалов непосредственно в клетки-мишени с надеждой на борьбу с болезнями. Эти ДНК-плазмиды представляют собой сверхбольшие молекулы. Фигура 5 представляет собой хроматограмму SEC / DLS ДНК-плазмиды, показывающую равномерное Rh приблизительно 45 нм по всему разделению. Данные статического рассеяния света показали экстраполированную молекулярную массу более 43 миллионов.

Рисунок 5

Выводы (Вернуться к началу)
Динамическое обнаружение рассеяния лазерного света можно легко добавить в любой прибор ВЭЖХ / SEC / FPLC, в настоящее время выполняющий определения молекулярной массы биомолекул. Такое высокочувствительное обнаружение в сочетании с определением гидродинамического радиуса (Rh) «на лету» позволяет по-новому взглянуть на конформацию и согласованность современных биомолекул.

Уникальная конструкция, объединяющая как статическое, так и динамическое рассеяние света в одной ячейке, обеспечивает новый инструмент для получения критической информации о пути для биомолекул. Эти выводы помогут исследовательским отделам разрабатывать улучшенные фармакологически активные соединения и отделы контроля качества для лучшего контроля консистенции коммерциализированного продукта. DLS - это новый инструмент для исследований и контроля качества биомолекулярных характеристик 21-го века.

Рекомендации (Вернуться к началу)

1. Практическое онлайн определение молекулярного веса биополимера с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с классическим детектированием рассеяния света, Dollinger et.al, Journal of Chromatography, 392 (1992), 215-228.

Для получения дополнительной информации: Джон П. Хелфрич, директор, Life Science Group, Precision Detectors Inc., 10 Forge Park, Franklin MA 02038. Тел: 508-520-8765. Факс: 508-520-8772. Электронная почта: [email protected].

Похожие